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關閉窗口 一. 儀器及試劑
儀 器：
（1）天平一臺（精度0.1mg）；
（2）恒溫水浴鍋一臺；
（3）容量瓶；
（4）試管（1.5×15cm或1.5×10cm）；
（5）微量進樣器（5ul或10μl）一支；
（6）微量可調移液槍（1000ul）一支、吸頭多個；
（7）旋渦混勻器一臺；
（8）HPLC系統及氨基酸分析專用柱（4.6×250mm）；
試 劑：
（1）超純水（≥18M?·cm）；
（2）乙腈（HPLC級）；
（3）三水合醋酸鈉（分析純）；
（4）冰醋酸（分析純）；
（5）衍生試劑A和衍生試劑B溶液，至于冰箱保存（衍生試劑包對身體有害，用時請做好防護措施）；
（6）正己烷（HPLC級）。
二. 流動相的配制
流動相A： 0.1mol/L醋酸鈉溶液（pH 6.5）：乙睛＝93：7
配制方法：準確稱取三水合醋酸鈉13.6g于1000ml水中，攪拌均勻，使之溶解，用冰醋酸或氫氧化鈉溶液調pH值至6.5；準確量取配制好的三水合醋酸鈉溶液 465ml和乙腈35ml，混合均勻，抽濾過0.45μm濾膜；
流動相B：水：乙腈＝20：80
配制方法：準確量取水100ml和乙腈400ml，混合均勻，抽濾過0.45μm濾膜；
三. 衍生化反應
1.對照品溶液的制備
取17種氨基酸對照品溶液用水稀釋至原來濃度的1/10倍稀釋作為對照品。
17種氨基酸對照品溶液稀釋10倍后，各氨基酸的濃度為：
Name | M.W. | C(mmol/L) | C(mg/ml) | Name | M.W. | C(mmol/L) | C(mg/ml) |
門冬氨酸 | 133.10 | 0.25 | 0.03328 | 胱氨酸 | 240.30 | 0.125 | 0.03004 |
谷氨酸 | 147.13 | 0.25 | 0.03678 | 纈氨酸 | 117.15 | 0.25 | 0.02929 |
絲氨酸 | 105.09 | 0.25 | 0.02627 | 蛋氨酸 | 149.21 | 0.25 | 0.03730 |
甘氨酸 | 75.067 | 0.25 | 0.01877 | 異亮氨酸 | 131.17 | 0.25 | 0.03279 |
組氨酸 | 155.15 | 0.25 | 0.03879 | 亮氨酸 | 131.17 | 0.25 | 0.03279 |
精氨酸 | 174.20 | 0.25 | 0.04355 | 酪氨酸 | 181.19 | 0.25 | 0.04530 |
蘇氨酸 | 119.12 | 0.25 | 0.02978 | 苯丙氨酸 | 165.19 | 0.25 | 0.04130 |
丙氨酸 | 89.093 | 0.25 | 0.02227 | 賴氨酸 | 146.19 | 0.25 | 0.03655 |
脯氨酸 | 115.13 | 0.25 | 0.02878 |
2.供試品溶液制備
精密量取/稱取供試品適量，并配制成相應濃度的溶液備用。
3.衍生步驟
1）將恒溫水浴鍋預熱至50±1℃；
2）分別將A、B兩種衍生試劑用稀釋劑稀釋至原來濃度的1/5倍；
3）精密量取上述對照品溶液1ml，置于試管中，加入稀釋后的A溶液0.5ml和稀釋后的B溶液0.5ml，搖勻；在50±1℃水浴中加熱45分鐘，取出，加入正己烷溶液1ml，振搖；并用孔徑為0.45μm有機膜過濾，放置30分鐘后，取澄清的下層液進行分析試驗；
4）供試品的衍生步驟與對照品相同；
四. 色譜條件
1.色譜柱：EXFORMMA Amino Acid，5μm，4.6×250mm；
2.梯度程序：
流動相A： 0.1mol/L醋酸鈉溶液（pH 6.5）：乙睛＝93：7
流動相B： 水：乙腈＝20：80
T(min) | A% | B% | |
0.01 | 100.0 | 0.0 | |
11 | 93.0 | 7.0 | |
13.9 | 88.0 | 12.0 | |
14 | 85.0 | 15.0 | |
29 | 66.0 | 34.0 | |
32 | 30.0 | 70.0 | |
35 | 0.0 | 100.0 | |
42 | 0.0 | 100.0 | |
45 | 100.0 | 0.0 | |
60 | 100.0 | 0.0 |
流速：1.0ml/min
柱溫：40℃
波長：254nm
進樣量：5μl色譜圖：
氨基酸標準品
溶解空白：
